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TEST PATAg – MISE EN EVIDENCE DES POLYSACCHARIDES

OBJECTIF

Visualisation polysaccharides sur des coupes de matériel végétal. Observation en microscopie éléctronique.

 

RÉACTIFS

  • Acide orthopériodique (acide périodique) H5IO6
    M = 227.94  (Prolabo, 20.593.151)
  • Thiocarbohydrazide, CH6N4S
    M = 106.15  Merck 12370
  • Protéinate d’argent (Roques special pour histologie)
    Prolabo 21.587.134
  • Acide acétique CH3COOH

PRÉPARATION DES SOLUTIONS

  • Acide périodique 1% (w/v) dans l’eau distillée.Thiocarbohydrazide (TCH) 0.2% (w/v) dans l’acide acétique à 20% (CH3COOH 2 ml, TCH 0.02 g, eau distillée 8 ml). Mettre à dissoudre au moins 1 heure à l’avance à température du laboratoire et sous agitation.
  • Acide acétique 20% (v/v).Protéinate d’argent 1% (w/v) en solution aqueuse. Mettre le volume d’eau choisi sous agitation et introduire très progressivement le protéinate d’argent. Filtrer deux fois sur le même filtre. Réaliser cette solution à l’abri de la lumière. Conservation à 4°C et à l’abri de la lumière (cette solution ne se conserve pas plus d’une semaine). Filtrer juste avant utilisation (filtre 0.45µm).

PROTOCOLE

Les échantillons sont préalablement inclus dans une résine. (les meilleurs résultats sont obtenus pour des échantillons ayant subi une double fixation (glutaraldéhyde-osmium et inclus dans une résine époxy). S’il est prévu de faire des marquages à l’aide d’anticorps (immunohistologie) sur des coupes sériées, il est fortement conseillé d’utiliser des résines hydrophyles de type acrylique et dans ce cas de ne pas faire d’osmication lors de la préparation des échantillons. Les coupes ultrafines (60 à 90 nm d‘épaisseur) sont recueillies sur des grilles en or (résiste au traitement à l’acide périodique) ou manipulées avec des anneaux (mais plus difficile pour les changements de solutions), elles sont mises à flotter sur :

 

  1. La solution d’acide périodique pendant 30 minutes à température ambiante.
  2. Des bains successifs d’eau distillée afin d’éliminer l’acide périodique (lavages de 30 minutes minimum).
  3. La solution de TCH-acétique pendant la nuit (couvrir pour éviter une évaporation)
  4. Des bains de lavages d’acide acétique 20%, puis diluer progressivement pour terminer par des lavages à l’eau distillée (30 minutes minimum).
  5. La solution de protéinate d’argent pendant 30 minutes à l’obscurité (si vous voyez la solution se troubler à proximité des grilles, le protéinate précipite : refaites une solution et ou rincer mieux les coupes (traces d’acidité).
  6. Des bains successifs de lavage d’eau distillée.
  7. Laisser sécher et observer.

INTERPRÉTATION

La première étape consiste en une oxydation périodique des fonctions vic-glycols (vic pour vicinales et glycols pour les alcools primaires portés par les cycles osidiques). Cette oxydation conduit à la formation de fonctions aldéhydes. La seconde étape consiste à révéler les fonctions aldéhydes formées lors de l’oxydation périodique. Le TCH se condense sur les fonctions aldéhydes et il est visualisé après réaction avec le protéinate d’argent. Cela conduit à la présence de grains d’argent au niveau des structures réactives (conférant à l’échantillon une densité aux électrons).

 

Contrôle : Substituer l’acide périodique par une oxydation avec H2O2 (20 à 30 min avec 5-10% H2O2)

 

Interprétation :

Le test PATAg révéle les fonctions vic-glycols. Cela n’est pas superposable exactement à polysaccharides. Les composés en C1-C3 n’ont pas de telles fonctions, de même pour les composés présentant des chaînes latérales sur les OH des carbones C2 ou C3. Enfin des composés non polysaccharidiques peuvent réagir car présentant des fonctions vic-glycols.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES :

  • Voir les travaux de Jean-Claude Rolland et Brigitte Vian

Exemple d’image

 

Image en microscopie élétronique à transmission

Cellules de l’épitheme dans un hydathode de chou.

On peut voir dans les cellules parenchymateuses les vacuoles (v), les chloroplastes (chl) riches en grains d’amidon très contrastés (du fait de leur nature en α 1-4),  les parois cellulaires, des méats (*) et lacunes. (barre d’échelle de 3 µm).

 

Image : Marie Christine Auriac.

Auteur

Plateforme de microscopie de la fédération de Recherches Agro Biosciences Interactions Biodiversité.

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