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MARQUAGE PARIETAL DE RACINE D’ARABETTE A L’IODURE DE PROPIDIUM ET COMPTAGE DES CELLULES PAR CELL-O-TAPE SUR LE LOGICIEL GRATUIT IMAGEJ

OBJECTIF

Marquer les parois cellulaires de cellules de racine d’arabette pour permettre le comptage des cellules du méristème grâce au plugin cell-o-tape du logiciel imageJ /Fiji. L’objectif est de comparer différents génotypes dont la croissance des racines est modifiée. Manipulation réalisée sur des plantules d’arabette de 10 jours.

 

RÉACTIFS

  • Iodure propidium (IP) → C27H34I2N4 → MW : 668,4 g/mol
  • Des verres de montres ou cupule en verre pour incuber les racines

PRÉPARATION DES SOLUTIONS

  • Solution stock d’iodure de propidium à 1g/mL à garder au congélateur.
  • Solution aqueuse d’iodure de propidium à 10µg/mL à préparer au moment de la manip à partir de la solution stock.

Attention

L’iodure est un intercalant de l’ADN qui doit être manipulé avec des protections (gant/ blouse) et éliminé en conséquence.

PROTOCOLE

  1. Préparer suffisement de solution diluée pour incuber les racines à marquer.
  2. Mettre les racines dans des cupules ou dans des verres de montre pour les immerger dans l’iodure de propidium (2mL par cupule, plusieurs racines peuvent être mises dans le même contenant)
  3. Incuber 20 minutes
  4. Rincer dans de l’eau distillée 1 minute pour retirer l’IP en surface des cellules
  5. Monter entre lame et lamelle dans l’eau.
  6. Observation au confocal : Les réglages sont ceux d’un marquage fluorescent rouge (excitation : laser 552nm ou 561nm, réglage PMT de 560 à 650nm environ). Choisir un objectif et un zoom permettant de bien différencier les cellules, même celles étroites du méristème.
  7. Ajuster la mise au point afin de trouver le plan médian de la racine et identifier les cellules du centre quiescent. Il faut aussi pouvoir suivre la ligne de cellule qui, partant du centre quiescent, longe le cylindre central en remontant vers le haut de la racine (cf. interprétation).
  8. Acquérir la/les images allant de la pointe racinaire jusqu’à la zone d’élongation.

ANALYSE

  1. Ouvrir l’image sous le logiciel imageJ ou fiji
  2. Vérifier que l’image est en 8 bits
  3. Activer le plugin cell-o-tape (CPIB Tools)
  4. Faire un clic droit sur l’outil trait pour définir une ligne segmentée ou une ligne courbe
  5. Tracer un trait partant de l’intérieur d’une cellule du centre quiescent jusqu’à l’intérieur d’une cellule de la zone présumée d’élongation. Le trait doit passer au centre des cellules et couper les parois pour permettre la mesure.
  6. Cliquer sur l’icône pour lancer la mesure. Une nouvelle image apparait avec une ligne rouge et des points sur les parois détectées par le logiciel.
  7. S’il y a trop ou pas assez de parois identifiées, ajustez les valeurs de “stringence” et “low threshold” et testez les nouveaux paramètres en cliquant sur OK.
  8. Les résultats sont enregistrés dans le fichier log au format .txt et pouvant être réouvert sous excel. La première colonne indique le numéro de la cellule, la deuxième colonne sa longueur.

INTERPRÉTATION

Le marquage iodure de propidium (IP) va marquer les parois cependant, si l’incubation est trop longue il va également marquer les noyaux des cellules mortes. Il ne faut donc pas laisser trop longtemps dans l’IP ni fixer les racines avant coloration (l’IP rentrerait immédiatement dans les cellules).

Définition

La limite entre méristème et zone d’élongation reste floue et varie selon les publications. Nous avons choisi de définir cette transition ainsi : la zone méristématique s’arrêtera à la dernière cellule qui sera suivi de 2 cellules 2 fois plus grandes.

Obtenir une image de l'ensemble

Il est généralement nécessaire de faire plusieurs images pour couvrir toute la zone à analyser. Avoir une platine motorisée pour faire des mosaïques d’image facilite la tâche. Sinon faire plusieurs images et les recoller par ordinateur par la suite.

Références bibliographiques

Exemple d’image

 

Auteur

Plateforme de microscopie de la fédération de Recherches Agro Biosciences Interactions Biodiversité.

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