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CUTICULE DE L’EMBRYON DANS DES GRAINES D’ARABETTE EN MICROSCOPIE ELECTRONIQUE

OBJECTIF

Méthode pour visualiser à l’échelle ultrastructurale la cuticule à différents stades de développement de l’embryon dans des graines d’Arabette (Arabidopsis thaliana) en microscopie électronique en transmission.

 

PRÉALABLE

Cette méthode comprend une première étape de fixation. Les échantillons peuvent être des graines d’Arabette entières mais dont les téguments ont été percés par une fine aiguille, ou des graines coupées en deux afin de faciliter la pénétration du fixateur et des différentes solutions utilisées pour la déshydratation et l’imprégnation de la résine.

RÉACTIFS

  • Solution aqueuse comprenant 4% de paraformaldéhyde, 2.5%  de glutaralédyde dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1M.
  • Bains d’éthanol (EtOH) à concentration croissante : 20%, 40%, 60%, 80%, 100% (2 fois)
  • Résine LRWhite

PROTOCOLE

  1. Le fixateur utilisé est une solution aqueuse comprenant 4% de paraformaldéhyde, 2.5%  de glutaralédyde dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1M. Les échantillons sont maintenus dans le fixateur pendant 3 heures  à température ambiante puis une nuit à 4°C.
  2. La seconde étape de déshydratation comprend différents bains d’éthanol (EtOH) à concentration croissante, selon la séquence suivante : 20%, 40%, 60%, 80%, 100% (2 fois), chaque bain pendant 1 heure à température ambiante. Puis la nuit à 4°C dans l’éthanol 100%.
  3. La troisième étape consiste à faire pénétrer la résine. La résine LRWhite a été utilisée. L’infiltration a suivi la séquence suivante : 1/3 résine LRwhite dans EthOH, 1h30 à 4°C, 50% résine LRWhite dans EtOH une nuit à 4°C, 2/3 résine LRWhite dans EtOH 1h30 à 4°C, puis 100% résine LRWhite 48h à 4°C.
  4. Les échantillons sont mis en gélule dans de la résine LRWhite et le tout est mis pour polymérisation à 60°C pendant 24 heures.
  5. Des coupes ultrafines (80 nm) sont faites au couteau de diamant, déposées sur des grilles pour microscopie électronique. Les coupes sont ensuite contrastées à l’osmium (solution de 1 %), les sections étant déposées directement sur une goutte de solution déposée sur du parafilm. Les temps de contact ont été de 2-3 min à 10 min maximum. La manipulation se fait sous hotte chimique. Les grilles sont rincées à l’eau, séchées et observées en microscopie électronique à transmission.

Exemples d’image

Images brutes de traitement

L’embryon (Emb) est séparé de l’albumen (A) par une cuticule continue (indiquée par les flèches). Cette cuticule est fortement réactive à l’osmium et présente une densité forte aux électrons (d’où le trait noir). Contraste sur goutte d’osmium de 10 min. Barre d’échelle : 0,4 µm.
Contraste sur goutte d’osmium de 3 min. Barre d’échelle est de 0,5 µm.

Auteur

Plateforme de microscopie de la fédération de Recherches Agro Biosciences Interactions Biodiversité et CMEAB (Centre de Microscopie Electronique Appliquée à la Biologie · Faculté de Médecine Rangueil-Toulouse)

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